PROGRAMMA 

Il corso si propone di introdurre gli elementi di base per lo studio di sistemi sperimentali di interesse biotecnologico e dei Bioreattori per la medicina rigenerativa

• Differenze tra eucarioti e procarioti: la compartimentazione. Il dogma centrale della biologia molecolare: cenni sulla trascrizione e traduzione. Struttura e funzione dei principali biopolimeri cellulari eucariotici quali RNA (mRNA, tRNA, rRNA), DNA (genoma, cromosomi, cromatina e geni), proteine (struttara I°, II°, III°, IV°). Sintesi, degradazione e folding delle proteine. Genotipo e fenotipo cellulare. La segnalazione cellulare. Il metabolismo cellulare. Il ciclo cellulare (G1, S, G2, M) e le cellule quiescenti/senescenti (G0). La mitosi. I fattori di crescita. Sincronizzazione del ciclo cellulare. Cenni sulla meiosi.
• Cenni sui principali sistemi sperimentali di interesse biotecnologico: colture di cellule eucariotiche. L'apoptosi e la necrosi. Cellule primarie e linee cellulari. Tecniche di fusione cellulare (ibridomi) e principali applicazioni: la produzione di anticorpi monoclonali (mAbs). Differenze tra mAbs e anticorpi policlonali e tra anticorpi I° e II°. L’utilizzo degli anticorpi nelle tecniche Western Blot, Saggio Immuno-Assorbente legato ad un Enzima (ELISA), citofluorimetriche e immunofluorescenza (immunoistochimica – IHC e immunocitochimica – ICC abbinate al trasferimento di energia per risonanza – FRET) per la rilevazione di marker cellulari (Cluster of Differentiation, CD). Procedure di estrazione delle proteine da campioni biologici. Tecniche cromatografiche e elettroforetiche (SDS-PAGE) per la purificazione e/o separazione delle proteine. Il sequenziamento peptidico. Cenni di proteomica. La zimografia e la FRET per la valutazione dell’attività enzimatica. Esempi pratici tratti dalla bibliografia scientifica.
• Metodi per il trasferimento genico (trasfezione e trasduzione) in cellule eucariotiche e terapia genica. Tecniche di clonaggio del DNA mediante plasmidi e virus come vettori di clonaggio: trasfezioni stabili e transienti. I geni reporter. Over-espressione genica e silenziamento. Metodi chimici (polimerici e lipidici) e fisici (microiniezione, nanoparticelle ferromagnetiche, elettroporazione e gene gun) per trasfettare. Valutazione della trasfezione: efficienza di trasfezione e citotossicità. Parametri chimico-fisici rilevanti per la valutazione di un trasfettante: il rapporto di carica, le dimensioni e la carica delle particelle. Esempi pratici tratti dalla bibliografia scientifica. Estrazione purificazione degli acidi nucleici, PCR, PCR in tempo reale, sequenziamento, microarray a DNA e RNA. Enzimi di restrizioni, ligasi e fosfatasi. Esempi pratici tratti dalla bibliografia scientifica.

L’eredità delle caratteristiche biologiche: alterazioni del messaggio genetico; origine e tipi di mutazioni genetiche. La natura molecolare di alcune malattie ereditarie. Lo sviluppo embrionale: crescita, differenziamento e morfogenesi. I tre paradigmi della biologia dello sviluppo. Il controlo genetico della forma dell’organismo.

La nuova genetica e la medicina molecolare. L’ingegenria genetica: la diagnosi molecolare e la terapia genica. Topi blu e topi KO. Le prospettive della terapia genica sull’uomo. Biotecnologie farmaceutiche. Clonazione terapeutica e ingegneria dei tessuti.

Cenni di biologia cellulare per bioprocessi; progettazione del medium; ingegneria dei bioreattori; cinetica delle colture cellulari nei bioreattori; colture cellulari nei bioreattori; valutazione dell’efficienza dei bioreattori.

Coltura e ingegenrizzazione di cellule e tessuti, metodi ingegneristici per lo sviluppo in vitro di tessuti ingegnerizzati, parametri di progettazione di tessuti ingegnerizzati in vitro. Lo stato di sforzo idrodinamico generato sulle cellule in coltura perfusa, la stimolazione meccanica, elettrica e magnetica di costrutti cellulari ingegnerizzati.

Ingegneria dei processi di coltura cellulare: strumentazione on-line e controllo di processo, apporto dinamico di nutrienti, ritenzione cellulare e perfusione, effetti della variazione dimensionale dei bioreattori. Progettazione e realizzazione e utilizzo di bioreattori per vasi , cartilagine, ossa, muscoli.

Le applicazioni cliniche della medicina rigenerativa (Ingegneria della cute, Ingegneria della cartilagine, Ingegneria del tessuto osseo)

Gli aspetti etici e normativi della medicina rigenerativa.

PROGRAM

The course aims to introduce the basic elements for the study of experimental systems of biotechnological interest and the bioreactors for Regenerative Medicine

• Differences between prokaryotes and eukaryotes: cell compartmentalization. The central dogma of molecular biology: short notes on transcription and translation. Notions on the structure and function of major eukaryotic cell biopolymers such as RNA (mRNA, tRNA, rRNA), DNA (genome, chromosomes, chromatin and genes), proteins (from primary to quaternary structure). Protein synthesis and degradation, folding, unfolding and misfolding. Cell genotype and phenotype. Cell signaling and metabolism. The cell cycle (G1, S, G2, M) and quiescent/senescent/terminally differentiated cells (G0). Mitosis. Growth factors. Synchronization of the cell cycle. Short notes on meiosis.
• Notes on experimental systems of biotechnological interest: eukaryotic cell culturing techniques. Apoptosis and necrosis. Primary cultures (tissue explants) and immortalization of primary cell (i.e. establishment of cell lines). Cell fusion techniques to produce hybridomas and main applications: the production of monoclonal antibodies, mAbs. Differences between mAbs and of polyclonal Abs and between I° and II° Abs. The use of Abs in Western Blot, Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunofluorescence (immunohistochemistry – IHC and immunocytochemistry – ICC coupled to Förster resonance energy transfer – FRET) and flow cytometry (FCM) techniques to detect cell markers (Cluster of Differentiation, CD). Protein extraction from tissues and cultured cells. Chromatographic techniques for isolating and purifying proteins. Peptide sequencing. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to separate proteins. Overview of proteomics. Zymography and FRET for the evaluation of enzyme activity. Practical examples drawn from current literature.
• Methods for gene transfer (transfection and transduction) in eukaryotic cells and gene therapy. DNA cloning techniques using plasmids and viruses as cloning vectors: transient and stable transfections. Reporter genes. Over-expression and gene silencing. Chemical (cationic lipids and polymers) and physical methods (microinjection, ferromagnetic nanoparticles, electroporation and gene gun) for gene delivery. Assessment of transfection: Transfection efficiency and cytotoxicity. Chemical and physical parameters relevant to the assessment of transfectants: charge ratio, complex size and charge. Practical examples drawn from the scientific literature. Extraction and purification of nucleic acids, Southern and Northern blot techniques. Polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription PCR and real time PCR. DNA sequencing. DNA and RNA microarrays. Restriction enzymes, ligases and phosphatases. Practical examples drawn from the literature.

Molecular nature of some diseases. Embryonic development: growth differentiation and morphogenesis. The three paradigms of biological development. Genetic control of the shape of the body. Molecular medicine and new genetic approach. Molecular diagnosis and gene therapy. Transgenic mouses. Pharmaceutic biotecnology. Terapeutic cloning and tissue engineering.

Cellular biology in bioprocesses; medium planning; engineering of the reactors; kinetic of cellular culture in bioreactors; bioreactors efficiency appraisal.

Cell culture process engineering: on-line instrumentation and control of the process, dynamic perfusion and cellular metabolism. retention cellular and perfusion. Dimensional design of bioreactors. Micro-carries technology.

Control and design of bioreactors for vessels, bone cartilage, muscle engineering. Clinical applications in Regenerative Medicine. Regulatory aspects in clinical use of bio-engineered tissues.