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Obiettivi
Il corso si propone di fornire agli allievi nozioni relative alle substrutture cellulari e alla loro caratterizzazione meccanica, oltre ai meccanismi di adesione e trasporto cellulare. L'obiettivo del corso è quello di fornire sia i concetti di base, sia le nozioni teoriche per comprendere i modelli matematici interpretativi dei fenomeni e di affrontare anche alcuni aspetti legati alle tecniche sperimentali utilizzate per la caratterizzazione meccanica a livello molecolare/cellulare.
Programma delle lezioni e delle esercitazioni
Caratterizzazione struttura-funzione delle principali substrutture e strutture della cellula.
Introduzione alla cellula: DNA, RNA, proteine; struttura di impaccamento del DNA; struttura e funzione di proteine, meccanismi di riconoscimento molecolare; folding di proteine, misfolding e patologie legate al misfolding proteico (malattie prioniche e formazione di fibre amiloidi nelle malattie neurodegenerative).
Meccanica della membrana cellulare: modelli di membrana, costituenti della membrana; comportamento della membrana cellulare, zattere lipidiche, fluidità di membrana; trasporto attraverso la membrana (passivo, attivo, mediato da proteine); membana cellulare nei batteri; trattamento della sepsi mediante dispositivi extracorporei: interazione farmaco-lipopolisaccaridi (analisi dell’interazione mediante meccanica molecolare), analisi multiscala dell’efficienza del dispositivo.
Meccanica del citoscheletro cellulare: citoscheletro, filamenti intracellulari, struttura e funzione di microtubuli, filamenti di actina e filamenti intermedi; polimerizzazione e disgregazione dei filamenti; struttura di cilia, flagelli e villi. Sistemi di trasporto lungo i filamenti. Meccanismo di adesione cellulare; adesione e comunicazione cellula-cellula (gap junction); meccanismi di adesione cellula substrato, sistemi biomimetici. Meccanismi di locomozione cellulare e analisi delle modifiche del citoscheletro cellulare durante la migrazione.
Caratterizzazione meccanica dei filamenti: esperimenti per la misura diretta e indiretta delle proprietà meccaniche di filamenti (test di trazione con AFM, misura della rigidezza flessionale, stima del modulo di Young). Teoria dei biopolimeri: definizioni, comportamento a flessione dei filamenti; lunghezza persistente; energia necessaria per deformare un filamento; fluttuazioni dei filamenti; costante elastica; teoria dei filamenti corti e lunghi. Modelli cellulari: modelli matematici interpretativi del comportamento meccanico delle cellule, modelli continui e modelli discreti, modelli multiscala.
Proteine motore: struttura e funzione delle proteine motore (miosine e chinesine); meccanismi di trasporto attivo e direzionalità del moto; modelli meccanici interpretativi dei cambiamenti conformazionali di miosina e chinesina; struttura e meccanismo di movimento della dineina. Meccanismi browniani di trasporto: tecnica delle cellule per lo spostamento unidirezionale di sostanze ad alta efficienza; equazioni di diffusione; equazione di Langevin; ratchet model e modelli descrittivi del processo di diffusione. Macchine molecolari e attuatori molecolari biologici e sintetici.
Aspetti tecnologici ed applicativi di strutture molecolari e cellulari
Principali metodi di indagine utilizzati per la visualizzazione, la manipolazione e la caratterizzazione di molecole e di cellule (microscopia elettronica, trappole ottiche e magnetiche, microscopia a forza atomica). Le trappole ottiche: tecniche per la manipolazione di singole molecole; principi di funzionamento, allestimento, calibrazione ed esempi di applicazione delle trappole ottiche.
Tecniche per la manipolazione di cellule e microdispositivi (microchip): fondamenti teorici, tecniche di realizzazione ed esempi applicatici (sorting cellulare, coltura cellulare in microsistemi, applicazioni di high-throughput screening).
Applicazioni terapeutiche di vescicole fosfolipidiche.
Gli argomenti delle lezioni saranno integrati con 6 esercitazioni da 3 ore ciascuna con l'obiettivo di approfondire e integrare con esempi applicativi ed calcoli analitici i seguenti aspetti:
- modellazione molecolare: leggi fondamentali ed esercizi
- caratterizzazione della membrana cellulare mediante micropipette: eritrociti e leucociti
- microscopia a forza atomica e meccanica dei filamenti del citoscheletro
- trasporto di sostanze all’interno della cellula: confronto tra trasporto diffusivo e attivo
- proteine motore: modello meccanico dei cambiamenti conformazionali della miosina
- strutture biomimetiche adesive
Attività di laboratorio
Il programma delle lezioni e delle esercitazioni sarà integrato con 7 laboratori da 3 ore. 4 laboratori sono orientati all’approfondimento delle tecniche di meccanica molecolare e alla analisi del comportamento di molecole: il primo laboratorio sarà incentrato sugli aspetti di base, il secondo sull’analisi del comportamento di un fosfolipide in acqua e il terzo e il quarto alla analisi della conformazione e della resistenza meccanica di strutture secondarie che compongono filamenti e proteine del citoscheletro cellulare. 2 Laboratori sono orientati all'approfondimento dei sistemi microfluidici per colture cellulari: un laboratorio sarà incentrato sugli aspetti di progettazione e il secondo sugli aspetti di fabbricazione e messa in opera dei dispositivi. Il 7° laboratorio sarà invece incentrato sulle tecniche di visualizzazione e analisi semiquantitativa della morfologia cellulare basata su immagini in fluorescenza.
Prerequisiti
Nessuno
Cellular Bioengineering
Structural and functional characterisation of principal cell structures and substructures.
Introduction to the cell: DNA, RNA, proteins; DNA packing structure; protein structure and function, molecular recognition mechanisms; protein folding and misfolding, pathologies due to protein misfolding (prionic diseases and formation of amyloid fibers in the neurodegenerative diseases).
Cell membrane mechanics: membrane models, membrane components; behavior of the cell membrane, lipid rafts, membrane fluidity; transport through the membrane (passive, active, protein mediated); bacterial cell membrane; the treatment of sepsis via antibacterial extracorporeal devices: drug-lipopolysaccharide interaction, multiscale analysis of the device efficacy.
Cell cytoskeleton mechanics: cytoskeleton, intracellular filaments, microtubules structure and function, actin filaments and intermediate filaments; polymerization and disaggregation of filaments; structure of cilia, flagella and villi. Transport mechanisms along the filaments. Cell adhesion mechanism; cell-cell adhesion and communication (gap junction); cell-substrate adhesion; biomimetic systems. Cell motion mechanisms and analyses of cytoskeleton modifications during cell migration.
Mechanical characterization of the filaments: experiments for the direct and indirect measurement of the mechanical properties of the filaments (elongation test via AFM, measurement of the flexural rigidity, estimate of the Young modulus). Biopolymers theory: definitions, bending behaviour of the filaments; persistent length; energy needed to deform a filament; fluctuations of the filaments; elastic constant; short and long filaments theory. Cell models: mathematical models that interpret the mechanical behaviour of cells; continuous and discrete models; multiscale models.
Motor proteins: structure and function of the motor proteins (myosins and kinesins); active transport mechanisms and motion directionality; mechanical models that interpret the conformational changes of myosin and kinesin motors; structure and motion mechanism of dynein. Brownian transport mechanisms: cells technique for the high efficiency unidirectional transfer of compounds; diffusion equations; Langevin equation; ratchet model: descriptive models of the diffusion process. Molecular machines, biological and synthetic actuators.
Technological and applicative aspects of cellular and molecular structures.
Microscopy techniques used for the visualization, manipulation and for the characterization of molecules and cells: AFM, optical traps, magnetic traps. Optical traps; techniques for the manipulation of single molecules; basic physical principles, set-up, calibration and applications of optical traps.
Techniques for the manipulation of cells and microdevices (microchip): basic theoretical aspects manufacturing processes, and applications (cell sorting, cell culture micro-systems, high-throughput screening applications).
Therapeutic applications of phospholipid vesicles.
The lectures’ topics will be integrated with 6 tutorials (3 hours each) in order to go into the main aspects of the course and to introduce applications:
- molecular modeling techniques: fundamentals and exercises
- cell membrane characterization by micropipettes: erythrocytes and leucocytes- atomic force microscopy and cytoskeleton filament mechanics
- transport inside the cell: comparison of purely diffusive and active transport strategies
- motor proteins: mechanical model of the miosin conformational changes
- adhesive biomimetic structures
The course will be supplemented by 7 laboratory sessions: 4 laboratories will be focused on molecular modelling: Lab 1 on basic principles, Lab 2 on phospholipids behaviour in water, Lab 3 and Lab 4 on the characterization of the conformation and of the mechanical response of secondary structures typically found in cytoskeleton filaments and proteins. 2 further laboratories will be focused on microfluidic systems for cell culture; the first one related to the design of microfluidic devices and the second one related to fabrication and set up of the device. The 7th Lab session is devoted to the qualitative and semi-quantitative analyses of fluorescence cell imaging.
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